植入前遗传学诊断筛查技术指征进展
指对诊断明确的疾病如染色体疾病、单基因疾病等在胚胎植入前进行针对性诊断。单基因疾病患者或者携带者可以通过单基因疾病
早在上世纪70年代末期ART引起世界瞩目之时,就有学者提出通过该技术筛查异常胚胎以降低流产风险的设想。随后不同学者提出可通过活检极体、1~2-细胞卵裂球细胞或者几个外胚层细胞进行染色体检测。1990年,英国学者进行了首例X连锁隐性遗传病P,卵裂球活检后通过PCR方法扩增Y染色体序列进行胚胎性别选择,植入女性胚胎,获得临床妊娠,了ART新[1]。1992年双色荧光原位杂交法(fluorescentinsituhybridization,FISH)作为另一单基因疾病性别选择方案,应用X及Y染色体性探针进行性别选择,并且可检测X及Y染色体非整倍体[2]。1995年,基于非整倍体与女性高龄、流产的相关性,多色FISH-PGS登上P舞台[3],主要对高龄女性进行几条染色体的非整倍体筛查,开创了PGS时代,并得到了推广。但FISH技术探针数目有限,荧光PCR、全染色体染色等技术可同时进行数目较多(9~10)染色体的PGS检测,使人们有了更好的选择[4]。由于亚端粒探针的研究,相互易位P方法也开始发展[5],极大地降低了这部分人群的流产风险。各种单基因疾病的P方法也在这段时间进展迅速。2001年基因芯片、2002年比较基因组杂交法、2003年单细胞测序法、qPCR等全染色体筛查(comprehensivechromosomescreening,CCS)技术进入人们的视野。2004年后,基因芯片-PGS的报道开始增加,并于2010年后成为国际上大多数生殖中心的主要P/PGS技术[6],单核苷酸多态(SNP)基因芯片可以快速简单地同时进行多种单基因疾病P,并同时可行23对染色体非整倍体筛查[7]。近年来,高通量测序技术可能成为最有潜力P/PGS技术。
P/PGS指征始终与遗传技术发展相适应。虽然P/PGS发展时间较短,但在P/PGS领域各种新的生物学技术临床速度非常快,目前P/PGS已成为ART技术的重要组成部分,极大地改变了ART面貌,使ART技术从单纯解决不孕不育问题转为成为优化妊娠结局的有利技术,并有可能对所有ART人群应用。1990年,P国际
工作组(InternationalWorkingGrouponpreimplantationgenetics)成立,其工作是对全球P的工作进行总结和指导。1997年,欧洲人类生殖与胚胎学会(ESHRE)P工作组成立,提出对高危人群进行PGS以提高成功率,并且每年进行数据统计以跟进P最新进展。2002年P国际学组(PIS)成立,并于2004年发表了P技术指南[8],该指南首次结合ART中心建立指南及PCR/FISH实验指南对P的各个环节给出指导意见,为建立高效有序的P中心提供了国际性指导方案,但是对P/PGS指征未给出明确的指导意见。2005年,ESHRE的P工作组在PIS指南的基础上进一步给出了P/PGS纳入指征指南,更具有实用性[9]。指征分为纳入及不纳入两类。P纳入诊断明确的、严重致畸或性且遗传可能性大(染色体重排可能性10%;单基因遗传比例25%~50%)的单基因疾病;易位型染色体问题;HLA配型且已有干细胞治疗手段的疾病列入遗传相关指征。PGS纳入RSA2次,每个中心可依地区、国家自行决定次数;RIF3次移植高级别胚胎失败;或者多次移植累计达10个胚胎失败;AMA36周岁。但是任何可能因卵巢刺激、卵泡穿刺、妊娠而产生并发症风险高的女性都不进行ART,生育力低下如AMA女性(40~45岁以上年龄)、基础FSH值15IU/L、体质量指数30kg/m2及其他不适合进行ART的疾病均不纳入,具体来说,窦卵泡数(AFC)数目7个,胚胎质量差不考虑。这一版本指南没有将男性因素不育作为PGS指征,是否将男性因素不育列为PGS指征争议较大。2006年,国际上还是倾向将严重男性因素不育作为PGS指征[10],并在多中心实践,主要原因为严重男性因素可导致胚胎染色体异常几率升高[11]:胚胎原发性染色体异常如三体、单体几率及性染色体异常几率增加;梗阻性与非梗阻性无精子症患者胚胎PGS结果显示非整倍体率均高于50%[12];严重少弱精子症患者的精子与对比非整倍体率显著升高[13];卵泡质内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)/精子获取(testicularspermextraction,TESE)-PGS后妊娠结局明显改善[14];补救ICSI后胚胎染色体异常高发,进行活检及PGS可有效地改善妊娠结局[15-16];男性年龄是否与胚胎非整倍体发生相关尚无,但一项基于胚胎的研究表明高龄男性(50岁,于女性年龄因素)囊胚形成率降低,胚胎非整倍体发生率显著增高[17]。男性因素对胚胎的影响仍需进一步研究,是否需要将补救ICSI及高龄男性纳入PGS尚无。
RSA、RIF、AMA、严重男性因素四指征也是目前进行PGS的主要医学指征。PGS一开始的设想为降低因染色体异常带来的植入失败、流产、引产及出生缺陷风险,高龄是女性妊娠结局较差的因素之一,也是最先提出的PGS指征,但一部分ART中心实践后显示,PGS可能减少了部分染色体异常的风险,但并未改善妊娠结局,而且降低了活产率。有2篇重要的针对AMA女性PGS效果的前瞻性队列研究均显示[18-19],与对照组相比,PGS组可移植胚胎数目明显降低,持续妊娠率明显降低,活产率明显降低。这2篇文章一经发表便引起巨大争议,也了国际社会对PGS的信心,直接导致2007年后PGS周期数的直转急下[20]。与此同时,针对RSA、RIF、男性因素指征进行的随机病例对照或者回顾性分析均不支持PGS有提高妊娠率的效果[21-23]。
虽然PGS负面评价不断,但大多数学者仍然认为PGS对妊娠结局有正面影响,主要集中在以下几个方面:①虽然活产率无明显提高,但流产率、多胎率有明显下降;②AMA女性PGS极大地降低了唐氏综合征发生风险,40岁高龄女性PGS更为经济[24];③PGS可减少高龄女性因反复流产造成的情感创伤,并降低中孕期流产风险;④部分人群还是可见明显的妊娠结局改善。
由于2007年前大多数ART-PGS使用卵裂球细胞活检+有限染色体FISH技术(PGS#1),大多数学者认为可能该技术的局限导致了PGS临床效果的差异。卵裂球活检有较高的局限性:①可能对胚胎发育潜能影响较大;②可能因活检或者固定过程导致细胞核碎裂、溶解致结果不准确;③早期胚胎嵌合体多发,卵裂球结果可能错误率较高。极体活检FISH-PGS后持续妊娠率提高,也从另一方面提示可能卵裂球活检对胚胎发育潜能的影响。而FISH技术局限性也很多:①FISH信号的解读困难;②FISH探针不能覆盖全部染色体;③不同指征人群可能产生非整倍体机制不同,导致FISH-PGS结果差异[25]。对Mastenbroek等[26]发表在新英格兰上的结果进行深入分析后,部分学者认为该团队经验不足,可能活检技术、细胞固定技术、FISH技术、FISH报告错误、患者选择偏倚造成最终结论不准确。基于卵裂球活检及FISH技术的局限性,国际社会开始提倡改变活检方式,同时进行CCS,终止FISH-PGS[27-28]。
PGS#2(2.0)与FISH-PGS(PGS#1)区别:①第5/第6日(D5/D6)囊胚外胚层活检或极体活检,不再采用第3日(D3)卵裂球活检;②采用基因芯片或者其他技术进行CCS,弃用FISH技术[29-30]。2010年ESHRE的P工作组呼吁评估PGS2.0临床效果[31],得到许多支持,随后CCS有利于ART妊娠结局的报道呈爆发式增长:卵裂球活检+比较基因组杂交基因芯片(aCGH)显著提高妊娠率,降低多胎妊娠及流产率[32];aCGH准确性较FISH提高,且植入率、妊娠率提高[33];time-lapsemonitoring结合aCGH-PGS较单纯PGS显著提高妊娠率[34-35];CCS结合囊胚移植显著提高了妊娠率、持续妊娠率、活产率,降低了流产率[36],且多胎风险降低;AMA(40~43岁女性)、RSA人群临床效果也令人满意[37-38]。美国2011—2012年PGS大数据分析显示37岁女性PGS后每周期活产率及每移植周期活产率较对照组显著提高[39];一些小型前瞻性研究显示[40],CCS显著提高预后较差女性的植入率与妊娠率。
PGS2.0主要指征同2005年ESHRE的P工作组发布指征,但增加了男性因素:精子常规检查异常;精子基因组衰
减(spermgenomedecay,S),包括染色体碎片化增加,染色质分散,非整倍体率增加等。这些男性可通过ICSI生育,但胚胎发生异常几率可能增高,应加入PGS指征。具体为:①指标异常需要ICSI助孕进行PGS[严重精子减少(5×106/mL);梗阻性或非梗阻性无精];②经皮TESE-ICSI。次要指征有:前次偶发染色体非整倍体流产;胚胎质量较差;选择性单胚胎移植。
2015年,一些IVF中心报道不加选择对所有IVF患者进行PGS显著提高了妊娠率[41],开始了是否对所有IVF患者进行PGS的争论。鉴于高通量测序技术的快速发展及利用胚胎培养液游离DNA的无创PGS的提出[42],未来有可能实现对所有胚胎进行损伤小但快速准确的染色体筛查。
虽然目前PGS2.0是选择胚胎、改善妊娠结局的一种较好的方法,其局限性也显而易见:①活检可能带来胚胎损伤、植入潜能下降、表观遗传变化及成年后可能的远期影响,亟需开发损伤更小甚至无创的检测方法以降低可能的影响;②目前PGS结果分析所需的时间超过24h,需要胚胎冷冻以选择合适时机移植,虽然现有研究显示新鲜胚胎和冷冻胚胎具有相似的妊娠结局[43],然而胚胎冷冻对胚胎发育的安全隐患一直是辅助生殖领域研究的焦点和热点,随着技术不断发展,缩短PGS出报告的时间,PGS2.0后新鲜囊胚的移植可能成为未来努力的方向;③现有PGS2.0检测技术都是基于全基因组扩增后的胚胎细胞DNA进行的分析,其分析的准确性有赖于扩增产物完整性,然而扩增偏倚无法消除,可能带来假阳性与假阴性,故目前定义的PGS仅是对非整倍体进行筛查,随着技术进步,是否可以扩大PGS的筛查范围,增加小片段重复缺失的筛查?④PGS2.0仍然无法预知嵌合体胚胎的结局,且PGS2.0对嵌合体的识别度可能较高,由于嵌合体胚胎可能发育成正常个体,也可能流产,嵌合体在所有早期异常核型流产中占比约2.88%[44],故难以界定嵌合体胚胎的妊娠结局,对嵌合体胚胎的移植前咨询成为目前难点,需要进一步研究。
PGS目前争论焦点已从PGS是否对临床有利转而讨论扩大PGS指征的必要性。虽然目前仍缺乏多中心前瞻性随机对照研究的支持[45],仍需要重新认识和评估PGS,不可否认的是2010年后国际上大多数ART中心已将囊胚活检+PGS(PGS2.0)+FET作为常规手段运用于主要指征人群(AMA、RIF、RSA、男性因素),主要目的在于降低该人群流产风险,提高成功率,且显示较好的效果,国际社会对PGS的认同已全面恢复。PGS2.0已极大地改变了ART面
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